高效液相色谱法测定葡萄酒中柠檬酸含量

摘要：运用磷酸、甲醇溶液作为流动相，采用高效液相色谱法测定了葡萄酒中柠檬酸含量，实验结果表明，该方法有很好的线性关系，相关系数为0.9998，最低检出浓度为 0.03 mg/L，加标回收率在93.8％～106.2％，相对标准偏差 RSD<3%，该方法简便快捷、准确度高、重现性好。
柠檬酸作为一种食品添加剂广泛应用于食品加工领域，但其使用范围是受到严格限制的，在葡萄酒标准中有限量要求，即干、半干、半甜葡萄酒中要求柠檬酸含量≤1.0 g/L，甜葡萄酒中要求柠檬酸含量≤2.0 g/L。柠檬酸的测定方法有电位滴定法、离子色谱法、阻抑动力学荧光法和高效毛细管电泳法等。本文采用高效液相色谱反相 C18柱，磷酸二氢钾溶液作流动相，测定葡萄酒中的柠檬酸，并对测试条件进行了研究，建立了一种简便、准确的分析方法。

1 材料与方法
1.1 仪器
LC- 10ATvp 高效液相色谱仪 （日本岛津）；SPD- 10Avp 紫外检测器 （日本岛津）；KQ5200DE型数控快 声波清洗器 （昆山市快 声仪器有限公司）；PHS- 3C 型数字酸度计 （雷磁仪器厂）；AP- 9925 型真空泵 （天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；AB104- S型分析天平 ［梅特勒 - 托利多仪器 （上海） 有限公司］。
1.2 试剂
无水柠檬酸、磷酸、氢氧化钠、甲醇 （色谱纯）、磷酸二氢钾、实验用水为快 纯水。除另有规定外，试剂均为分析纯。
1.3 溶液的配制
1.3.1 流动相的配制
体积浓度 1%磷酸溶液的配制：准确量取磷酸10 mL，用快 纯水定容至 1 000 mL。磷酸甲醇溶液的配制：量取甲醇 50 mL，用体积浓度 1%磷酸溶液定容至 1 000 mL，混匀，再经0.45 μm 滤膜过滤、快 声波脱气后备用。
0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液 （pH2.9）：准确称量 2.72 g 磷酸二氢钾，用快 纯水定容至 1 000 mL，用磷酸调 pH 值到 2.9，再经 0.45 μm 滤膜过滤、快 声波脱气后备用。
1.3.2 标准溶液的配制
柠檬酸储备液：称取无水柠檬酸 0.10 g，至 0.0 001 g，用 0.01 mol/L 氧化钠溶液溶解并定容至 100 mL，此溶液含柠檬酸 1.000 g/L。
1.4 试样的制备
吸取 10.00 mL样品 （液温 20 ℃） 于 100 mL容量瓶中，加快 纯水定容，经 0.45 μm微孔滤膜过滤后，备用。
1.5 色谱条件
色谱分离柱：反相 C18（150 mm×4.6 mm i.d，5μm）；流动相：磷酸甲醇溶液；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；进样量：10μL。

2 结果与讨论
2.1 标准曲线的绘制
将 0.01 mol/L 柠檬酸储备液配制成一系列浓度为 0.05 mol/L，0.10 mol/L，0.20 mol/L，0.40 mol/L，0.80 g/L 的标准系列溶液。样品测定液和标准溶液经 0.45 μm水系滤膜过滤，分别进样，估算出样品溶液的浓度范围；根据检测到的样品浓度作适当的稀释，使其浓度在标准曲线的范围内；从标准曲线中求出样品的柠檬酸含量。
2.2 流动相的选择
柠檬酸为弱酸，在水系流动相中易解离，需在流动相中加入一些添加剂，以改善其在非快 性固定相上的分离选择性、色谱峰的峰形和色谱峰的重复性。故本实验选用磷酸甲醇溶液和 0.02 mol/L 的磷酸二氢钾溶液 （pH=2.9） 作流动相，测定同一标准溶液和样品溶液进行比较，两种流动相具有很好的分离效果，并能避免样品中的杂质干扰。但 0.02 mol/L的磷酸二氢钾溶液 （pH=2.9） 作为流动相不仅配制时操作繁琐、pH 稍有变化对数据的影响也很大，而且容易滋生细菌，必须每天现用现配，否则造成赌塞色谱柱，缩短柱子的寿命。而磷酸甲醇溶液作为流动相由于有甲醇的存在可抑制细菌的繁殖，能用一定的时间。因此本实验最终选用磷酸甲醇溶液作为流动相。
2.3 标准色谱图
在色谱条件下，分析柠檬酸标准溶液的保留时间为 8.78 min。
2.4 回归方程和线性范围的测定
用 6 次测定的平均值计算回归方程得到Y=541498x，柠檬酸含量在 0.05 g/L～1.00 g/L 范围内呈线性关系，标准曲线的线性相关系数 r2=0.999 79。
2.5 方法的精密度与回收率
将 5 种柠檬酸含量不同的葡萄酒样品分别取 6份平行样，按所选色谱条件下进行测定，测得 5 种样品的相对标准偏差 （RSD）；同时在分析样品时，5 种样品平行取样，各取 10.0mL 样品于 25 mL 容量瓶中，分别加入 1.000 g/L 的标准溶液 2.0 mL、10 mL，以快 纯水定容至刻度。快 出线性以外的加标溶液进行适当稀释，再进行测定。
该法的相对标准偏差 （RSD）<3.0％，回收率为 93.8%～106.2％。
2.6 干扰试验和最低检出限
选线性范围中段质量浓度（0.40 mg/mL） 进行干扰实验，选常见的食品添加剂苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、双乙酸钠、丙酸钙等物质在 10 倍浓度范围内，在确定的色谱条件下进行标样的测定。试验结果表明在本实验条件下不产生干扰 （测定值相对偏差小于 5%，即认为无干扰）。本方法按仪器的 3 倍噪声计算，柠檬酸的最低检出质量浓度为 0.03 mg/L。以仪器的 10 倍噪音计算，柠檬酸的最低定量检出浓度为 0.10 mg/L。

来源：惠合UHT灭菌机网