快速通道:   网站首页      产品展示      UHT灭菌机知识      联系我们   
食品工程
您所在的位置:UHT灭菌机首页  >  食品工程

乳酸菌耐酸机理的研究


摘要:为研究乳酸菌的耐酸机理, 对 4 株乳酸菌株在人工胃液中的生存率及葡萄糖的影响作了分析, 当葡萄糖存在时, 耐酸菌株的生存率大大提高; 培养 24 h 后, 耐酸菌株的生物量大于非耐酸菌株, 菌液的 pH 值低, 非耐性菌株在酸性培养基的生长情况较差; 耐酸菌株能够消耗人工胃液中的葡萄糖并使悬浊液的 pH 值升高; 耐酸菌株的 ATP 酶活性小于非耐酸菌株。以上的结果可以看出, 耐酸菌株在酸性环境中可以较好的生长, 并具有可以在强酸性条件下利用碳源(如葡萄糖)进行代谢的耐酸机理, 而 ATP 酶活性不是影响耐酸性的主要因素。乳酸菌是利用糖类进行发酵代谢, 生成以乳酸为主的代谢产物的细菌的总称。乳酸菌对人体有多种保健作用, 人类在很久以前就把乳酸菌应用于发酵食品的生产了。如酸奶、奶酪等发酵乳制品的制造; 蔬菜腌渍食品等植物性发酵制品; 酒类和酱油等的酿造及肉类鱼类发酵食品的制作。
通过乳酸发酵, 食品的保存期得到了很大程度的延长, 但与此同时, 由于酸度上升, 乳酸菌的生存率大大降低。另一方面, 胃液的酸度非常大, 通常的 pH 在 3.0 以下, 对于微生物来说, 这是一个极其严峻的环境, 只有极少数的耐酸的乳酸菌才能以活菌的形式通过胃部。所以, 研究乳酸菌在酸性环境下的生长情况及耐酸机理, 对扩大乳酸菌的应用范围, 使人体摄取的乳酸菌能在体内最大限度的发挥保健作用是具极其重要的意义的。本研究探讨了耐酸和非耐酸乳酸菌株在酸性条件下的生长情况及耐酸性, 并观察了碳源对耐酸性的影响。

1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验菌株
Lactobacillus plantarum T- 32 ( 以下简称 T- 32) 、Lactis subsp.cremoris IFO3427(以下简称 IFO3427)和Lactobacillus casei subsp.casei JCM1134 ( 以下简称JCM1134) , 由日本千叶大学微生物工学实验室提供 ; Streptococcus salivarius subsp.thermophilus 510( 以下简称 510) , 由日本乳业技术协会提供。
1.1.2 培养基及试剂
1.1.2.1 培养基
普通 GYP 培养基 ( pH6.8) ; 酸性 GYP 培养基,普通 GYP 培养基灭菌后, 用盐酸调节 pH 值至 4.5和 3.8。
1.1.2.2 试剂
人 工 胃 液 : NaCl 0.2 g, 胃 蛋 白 酶 ( ICNBiomedicals) 0.35 g 溶于适量蒸馏水中, 用 HCl 调节 pH 至 2.0, 定溶 100 mL。孔径 0.22μm 微孔滤膜 ( Millex- GV) 过滤除菌。
ATP 酶粗酶提取试剂: 溶菌酶 mutanolysin(Sigma)和 N- Acetylmuramidase( 生化学工业) ; Protein Assay(Bio- Rad); 牛血清( BSA)( Sigma) ; 0.5mmol/LGlycyl-glycine- KOH- 2mmol/LMgCl2缓冲液 ( pH7.2) 。
ATP 酶活性测定试剂: 反应液由 60 mmol/LTris- HCl(pH8.0)、6 mmol/LMgCl2、6 mmol / LNa2ATP和 BSA 组成; 发色液由 2.5 mol / LH2SO410 mL、质量分数 2.5 %的 ( NH4)6Mo7O24·4H2O 10 mL、质量分数 3% Na2SO3- 1 %甲基氨基酸 ( methylaminophenol)硫酸盐 10mL、蒸馏水 40 mL 组成。0.1 mol / L HCl;KH2PO4。
葡萄糖定量试剂: GluAR- Ⅱ(和光纯药)试剂。
1.1.3 仪器设备
高速冷冻离心机、分光光度计、超净工作台、恒温水浴锅、恒温培养箱、pH 计。
1.2 试验方法
1.2.1 人工胃液中乳酸菌生存率的测定
37 ℃、2 mL/100 mL 的接种量进行乳酸菌的液体培养, 无菌条件下取 10 mL 菌液离心, 弃上清液, 加入无菌生理盐水洗涤后再离心。沉淀中加入5 mL 的人工胃液, 震荡均匀后放入 37 ℃恒温水浴锅。人工胃液加入后恒温 1 h 和 2 h, 分别取样稀释涂平板, 进行活菌计数, 以测定 2 h 后菌的生存率。在人工胃液中加入 50 mmol / L 葡萄糖溶液, 再用同样的方法测定生存率。
1.2.2 乳酸菌生长曲线和培养基 pH 变化的测定
将试验菌株接种于 10 mLGYP 液体培养基上,37 ℃培养 24 h。取菌液 1mL 接种于 50 mLGYP 液体培养基, 37 ℃培养。在一定时间取样, 测定其吸光度 ( 660nm) 和培养基 pH 值的变化。
1.2.3 ATP 酶粗酶液提取
37 ℃、2 mL/ 100 mL 的接种量进行乳酸菌的液体培养 ( 500mL) , 16 h 后菌液离心, 收集菌体并用预冷的 MgCl2溶液洗涤。加入 Glycylglycine- KOH- 2mmol / L MgCl2缓冲液至 100 mg 菌体 / mL 悬浊, 然后 加 入 溶 菌 酶 mutanolysin(50u/mL), N- Acetylmu-ramidase(10 mg/ mL), 40 ℃水浴中恒温 2 h。离心后,沉淀中加入 40 ℃的 MgCl2溶液 ( 10mg 菌体 /mL) ,40 ℃水浴中, 轻微震荡 30 min 左右, 离心除去未破碎的细胞, 收集细胞膜。MgCl2缓冲液悬浊, 用Protein Assay 试剂测定蛋白质含量, 直到蛋白质质量浓度为 1mg/ mL 左右, 制成粗酶液。
1.2.4 ATP 酶活性测定
定量曲线: 先在 500μL 反应液中添加不同浓度的 KH2PO4溶液 100μL, 37 ℃下反应 10 min, 然后加入 300μL 预冷的 0.1 mol / LHCl 终止反应。反应液在冰中放置 10 mim 后加入 2.1 mL 的发色液,18 ℃条 件 下 10 min 发 色 , 立 即 测 定 其 分 光 度( OD660nm) , 制成定量曲线。
500μL 反应液中添加 100μL 的粗酶液, 用定量曲线中同样的方法测定分光度。参考定量曲线,以 1 min 内 1μmol / L 的游离磷酸量表示 1 个单位;比活性用 1mg 粗酶液中的单位数表示。
1.2.5 葡萄糖定量
按 GluAR- Ⅱ试剂的使用说明, 先作标准定量曲线。取菌液 0.5 mL 离心后, 取上清 10μL 进行葡萄糖定量。

2 结果与分析
2.1 实验结果
2.1.1 人工胃液中乳酸菌生存率的测定
本项实验对 4 株乳酸菌分别进行了在含葡萄糖和不含葡萄糖的人工胃液中投入 2 h 后生存率的测定。在不含葡萄糖的人工胃液中,T- 32 和 JCM1134 菌株生存率分别为 0.26 %和 0.16%; 而 IFO3427 和 510 菌株的生存率则明显低下,为 0.00006 %及 0.00014 %。根据这个结果, 相对的把前两株菌株称作耐酸菌株, 后两株菌株称作非耐酸菌株。之后, 在含葡萄糖的人工胃液中再测定生存率, 结果发现, 耐酸菌株的生存率得到了很大的提高, T- 32 的生存率为 17.3 %, 提高了 66.5 倍;JCM1134 的生存率为 18.9 %, 提高了 118.1 倍。相对的, 非耐酸菌株的生存率则依然很低, 没有明显的变化。
在接下去的实验中, 选取 T- 32 和 510 菌株作为耐酸菌株和非耐酸菌株的代表, 进行两种不同类型的乳酸菌株的生理特性的比较。
2.1.2 乳酸菌生长曲线和培养基 pH 变化的测定
为了观察耐酸和非耐酸菌株在同一培养条件下及酸性条件下的生长情况, 以 T- 32 和 510 菌株为对象, 测定了在 pH 为 6.8、4.5 和 3.8 的三种 GYP液体培养基中菌的生长曲线和菌液 pH 的变化。总体来说, 在 pH 6.8 的培养基上,菌的生长最旺盛, 其中耐酸菌株 T- 32 的生长又比非耐酸菌株 510 要好, 培养 24 h 后, T- 32 最终的菌体量多于 510 株, 菌液 pH 值也较低。在 pH 4.5和 3.8 的酸性培养基中, 耐酸菌株保持了良好的生长状态, 而非耐酸菌株的生长状态不佳, 24 h 后菌液的 pH 值也几乎没有变化。
2.1.3 ATP 酶活性测定
根据文献的研究结果, 耐酸菌株细胞可以用利用质子泵 ( 即 ATP 酶) 排出进入细胞的质子从而维持细胞内的 pH。为了验证, 测定了耐酸和非耐酸菌株的 ATP 酶的活性。和预想的结果相反, 非耐酸菌株的 ATP 酶的活性高于耐酸菌株,差距约为 3.5 倍。
2.1.4 人工胃液 pH 变化及葡萄糖残存量测定
2.1.4.1 人工胃液 pH 变化测定
从上个实验可以看出, ATP 酶的活性并不是直接影响耐酸性的因素, 为了探索耐酸和非耐酸菌株之间生存率存在大差距的原因及葡萄糖存在与否对生存率的影响, 以 T- 32 和 510 菌株为对象, 进行了在含葡萄糖和不含葡萄糖的人工胃液中投入 2h后, 人工胃液 pH 变化的测定。两种情况下, 非耐酸菌株的 510 的人工胃液悬浊液的pH 值基本没发生变化; 而耐酸菌株的 T- 32 悬浊液的 pH 上升, 在有葡萄糖存在的情况下上升的幅度更大。
2.1.4.2 人工胃液中葡萄残存量测定
在测定人工胃液 pH 变化的同时, 还对含葡萄糖情况下人工胃液中葡萄糖残存量进行了测定。可以很明显的比较出, 耐酸菌株 T- 32 以较快的速度消耗了葡萄糖, 结合悬浊液 pH 上升的结果, 由此可以推断, 耐酸菌株可以在低 pH 条件下利用葡萄糖生成代谢产物, 使悬浊液的 pH 升高。
而非耐酸菌株 510 的悬浊液中葡萄糖含量则基本没有变化, 也就是说, 510 菌株不能利用人工胃液中的葡萄糖。
2.2 分析
从实验结果可以看出, 乳酸菌的耐酸机理较为复杂, 最起码有两种机理存在:
a) 在没有葡萄糖之类的碳源存在情况下的耐酸机理。一般说来, 在细胞内 pH 值比胞外 pH 值要高的情况下, 胞外的 H+要流入胞内, 从而导致细胞内 pH 下降, 引起细胞的死亡。耐酸菌株在人工胃液中的生存率远远高于非耐酸菌株, 而且实验结果也表明, 作为质子泵的 ATP 酶和耐酸性没有直接的关系。由此可以推测, 耐酸菌株细胞膜的通透性比非耐酸菌株的要低, 在同样条件下,流入细胞内的 H+量就少, 最终耐酸细胞的胞内 pH下降较少, 生存率就提高了。这个机理以后还要通过测定细胞内 pH 的变化等实验方法来验证。
b)葡萄糖存在时的耐酸机理。耐酸菌株在葡萄糖存在时生存率大大提高, 实验也证明耐酸菌株可以在强酸性条件下利用葡萄糖。葡萄糖被利用代谢后可以生成 ATP, 在 ATP 酶的作用下加水分解, 同时 H+排出胞外, 从而细胞内的 pH 值变化较小。非耐酸菌株的 ATP 酶活性虽然较耐酸菌株高, 但是他不能在强酸性条件下利用葡萄糖, 所以即使有碳源存在, 在人工胃液中的生存率也很低。

3 结论
a) 耐酸菌株在低 pH 条件下, 生存率相对较高,并且当葡萄糖存在时, 生存率有几十甚至上百倍的提高, 而非耐酸菌株的生存率变化则不大。
b) 培养 24 h 后, 耐酸菌株的生物量远远高于非耐酸菌株, 菌液的 pH 值也相对较低; 耐酸菌株在酸性培养基的生长情况和中性培养基上相似, 而非耐性菌株的生长情况较差。
c) 耐酸菌株的 ATP 酶活性小于非耐酸菌株, 表明 ATP 酶活性不是影响耐酸性的主要因素。
d) 耐酸菌株能够在人工胃液中消耗葡萄糖并使悬浊液的 pH 值升高, 而非耐酸菌株则不能。
e) 乳酸菌的耐酸机制较复杂。在没有碳源存在情况下, 推测耐酸菌株细胞膜的通透性比非耐酸菌株的要低, 导致酸对细胞的影响变小; 有碳源存在时, 耐酸菌株可以在强酸性条件下利用碳源从而提高生存率。

来源:惠合UHT灭菌机网


联系我们
有事联系我