牛奶中一株产酸克雷伯菌的检出

摘要：在市场销售的乳制品中检出一株产酸克雷伯菌，经试验该菌对青霉素有抗性。在已报道的产酸克雷伯菌中，大部分是在医院的临床病例，成品液态奶中检出该菌尚属首次。
这一菌株的检出给乳制品中内酰胺酶的检测带来新的问题。
克雷伯菌属是革兰氏阴性杆菌，无芽胞、有荚膜，为机会致病菌，包括很多种，如肺炎克雷伯杆菌，产酸克雷伯菌，植物生克雷伯菌和土生克雷伯菌。克雷伯菌为呼吸道常居菌群，在人及动物肠道中亦常见，其中产酸克雷伯菌已被确认为病原菌，由该菌引起腹泻的报导甚少。目前对产酸克雷伯菌的研究主要集中于对抗生素的抗性研究上，我们在对市售牛奶进行检测的过程中，分离到了 1 株产酸克雷伯菌。

1 材料和方法
1.1 材料来源
液态奶均为市场随机购买，总计 61 个样品，其中包括酸牛乳 11 个，巴氏灭菌乳 30 个，高温灭菌乳 10 个，奶粉 10 个。
1.2 培养基及试剂
营养肉汤增菌液、肠杆菌增菌肉汤、营养琼脂平板及青霉素药敏纸片，购自北京陆桥技术有限责任公司；生化鉴定使用 VITEK2C。
1.3 方法
称取液态奶25 g至在营养肉汤中，振荡混匀后36 ℃增菌 18 h，取 1 mL 转接于肠杆菌增菌肉汤中36 ℃18 h培养，用接种环分离划线于营养琼脂平板，倒置于培养箱中培养 24 h。进行菌落形态和细胞形态观察。

2 结果和讨论
2.1 VITEK 2C 全自动致病菌鉴定仪对菌株的鉴定
将菌株在平板上纯化后，经革兰氏染色确定为G-杆菌，确定使用 GN鉴定卡。经营养琼脂 37 ℃，24 h富集后，用性接种环刮取菌苔，研磨于灭菌质量分数0.85%的生理盐水中，使菌液的 OD 为0.5左右，于 VITEK 2C 全自动致病菌鉴定仪上鉴定，观察56 个生化反应，仪器数据库自动对结果进行分析，给出结果。共分离菌株 21 株，其中在巴氏灭菌乳中检出一例产酸克雷伯菌。
2.2对青霉素有抗性
药敏试验采用纸片扩散法，该菌在营养琼脂平板上进行涂布培养，在平板上放置青霉素药敏纸片（0.5IU），经 24 h 培养后，测定抑菌圈直径为 0 mm，产酸克雷伯菌在平板上均匀生长，未出现抑制现象，表明该菌对青霉素有抗性。
2.3 讨论
刘佩红等在对生鲜牛乳中的致病菌进行分离过程中，共分离到了254株分离菌，其中包括 1 株产酸克雷伯菌，该菌是否合成 β- 内酰胺酶还未可知。张秀芹等在对生鲜牛乳中内源性 β- 内酰胺酶的检测中发现，牛乳中的金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯菌及大肠埃希氏菌都可以使生鲜牛乳中产生内源性酶。但以上这两个研究发现仅限于生鲜牛乳中。目前国内在市售成品乳制品中检出产 β- 内酰胺酶的微生物尚无报道，本实验室在巴氏奶中检出一例产酸克雷伯菌，且对青霉素有抗性。分析其原因，该菌可能分泌青霉素酶，可以降解青霉素，进而在有药敏纸片的平板上生长，这给乳制品中该酶的检测带来干扰因素。
根据检测方法原理的不同，β- 内酰胺酶的检测可以分为微生物法、碘量法、产色头胞菌素法、酸度法等。微生物法又分为纸片扩散法和抑菌圈法，其基本原理相同，都是利用对抗生素敏感的细菌作为指示剂，根据菌体生长时产生的“有菌区”或“区”来判定该酶的多少，是检测 β- 内酰胺酶最常用的方法；碘量法是根据中华人民共和国药典（2005 年版）（二部）的推荐方法，通过青霉素和青霉素酶溶液反应后的产物青霉噻唑酸，与碘滴定液竞争性结合反应，利用滴定法来间接表示青霉素酶的活性；产色头胞菌素法和酸度法，这两种方法均利用反应产物的特点进行测定。
牛奶中 β- 内酰胺酶的来源有两方面：一方面是奶源中的菌株分泌的胞外酶，为内源酶；另一方面是人为添加用于乳制品中抗生素的降解，为外源酶。微生物法、碘量法等均是以乳制品中含有的酶量为报出结果，未考虑乳制品中的内源酶，耐抗生素产酸克雷伯菌的检出对检测方法产生干扰，而在成品奶中检出该菌，则应该加强乳制品的加工过程管理，热加工过程的除菌效果。

来源：惠合UHT灭菌机网