乳清蛋白的酶法改性研究

摘要：采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶在各自的适宜条件下对乳清蛋白粉进行水解，通过 HPLC 方法测定酶解产物中 α- 乳白蛋白 （α- La） 和β- 乳球蛋白 （β- Lg） 的含量。结果表明，碱性蛋白酶对其水解，其次为木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下则不易酶解，而且发现 α- La 比 β- Lg 更容易水解。
乳清蛋白 （Whey Protein） 是牛奶中的一种主要蛋白质，其含量仅次于酪蛋白，占牛奶中蛋白质质量的 18％~20％。其中 β- 乳球蛋白 （β- Lg）和 α- 乳白蛋白 （α- La） 是乳清蛋白的主要成分，分别占其质量的 40%～50%和 10%～20%左右。乳清蛋白具有较高的营养价值及功能特性，一直以来被广泛的应用于食品工业。但乳清蛋白又是一种常见的过敏原，其中 β- 乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要成分，其次为 α- 乳白蛋白。目前主要通过蛋白质改性的方法来控制和消除乳清蛋白过敏原。
蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低过敏反应的一种有效的方法。蛋白酶通过水解乳清蛋白的抗原决定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳过敏反应。同时可以产生一系列具有生物活性的肽，还能改善其功能特性，促使营养组成更趋合理、风味更为突出。水解产物可作为食品原料或添加辅料应用于营养配方食品、保健品、疗效食品、临床营养品、速溶饮品及方便食品，从而拓宽蛋白质应用范围，提高蛋白质使用价值，还可满足消化道蛋白酶分泌不足患者、老年人、运动员、肥胖症患者、婴儿等人群需要。
本文采用几种最常用的蛋白酶水解乳清蛋白，通过 HPLC方法测定水解产物中 α- La 和 β- Lg含量，以这两种蛋白的水解速率为指标，筛选出酶解α-La 和 β-Lg这两种过敏原的酶作为用酶，为牛乳蛋白过敏患者尤其是婴幼儿过敏患者开发低过敏或无过敏的乳蛋白制品提供方法和理论依据。

1 材料和方法
1.1 材料
乳清蛋白粉 （WPC 80），蛋白质质量分数为72.8%, 水分质量分数为 6.1%，美国 Proliant 公司；碱性蛋白酶 （Alcalase 2.4L），诺维信公司；木瓜蛋白 酶 （Papain 18）， 广 州 远 天 ； 风 味 蛋 白 酶（Flavourzyme 500MG），诺维信公司；中性蛋白酶，Amresco 公司；复合蛋白酶 （Protamex），诺维信公司；胰蛋白酶 （trypsin）、胃蛋白酶 （pepsin），sigma公司；L- 酪氨酸，BDH Chemicals Ltd Poole England。
1.2 仪器与试剂
Sartorious 电子分析天平，德国；THZ- 82 恒温振荡器，常州国华电器有限公司；DYCZ- 24D 双垂直电泳槽、DYY- 6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；高效液相色谱仪 （SPD- M10AVP），日本岛津公司；752 紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；792- 双向磁力加热搅拌器，江苏省金坛市医疗仪器厂；pHS- 25 型 pH 计，上海精科雷磁。
β- 乳球蛋白标准品、α- 乳白蛋白标准品、色谱纯乙腈，sigma 公司；三氟乙酸，北京津益化工厂。
硼砂、硼酸、氢氧化钠、乳酸、乳酸钠、甲醛均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 乳清蛋白水解工艺流程
选取碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶 7种蛋白酶在各自适宜的条件下进行水解。
称取一定量的乳清蛋白粉，根据酶的适宜pH，选取不同的缓冲液做溶剂配置成质量浓度为80 g / L 的乳清蛋白粉溶液加入反应容器中。达到酶解温度后，按照 1 000 U / g 加入相应的酶，在适宜条件下水解 30 min。反应在恒温水浴振荡器中进行。反应到终点用 1 mol / L 的 HCl 调节 pH 到 2，钝化酶。胃蛋白酶水解终点时加 1 mol / L 的 NaOH调节 pH 到 12 使酶失活。
1.3.2 测定方法
HPLC 法测定 α- La 和 β- Lg 的条件：KromasilC8 反相色谱柱 （5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为 A：体积分数 0.1%的 TFA 水溶液，B：体积分数0.09% 的 TFA 乙 腈 溶 液梯 度 洗 脱 。 流 动 相 B 在10 min 内从 20％上升到 50％，然后用 10 min 从50%上升到 80%，在 2 min 内由 80％降到 20％。流速为 0.8 mL / min；二快 管阵列检测器，检测波长：215 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
水解度的测定采用甲醛滴定法。
蛋白酶活力的测定采用紫外分光光度法。
α- La 和 β- Lg酶解率计算方法：
酶解率 （％） ＝m1- m2m1×，
式中：m1———酶解前的含量；
m2———酶解后的含量。

2 结果与讨论
2.1 蛋白酶活力的测定
酶活是反应酶水解底物的能力，本试验对蛋白酶的考察均按相同的酶活力加酶，即在相同的条件下考察了蛋白酶对 α- La 和 β- Lg的水解能力。
2.2 不同蛋白酶水解物中α-La 和β-Lg 的含量
用 HPLC 方法分析了蛋白酶的酶解产物。比较酶解前后的图谱可以看到，乳清蛋白粉经过酶解后，α- La 和β- Lg 的含量比酶解前降低，而且在 α- La 和β- Lg 的峰前产生许多小峰，说明酶解后产生了大量的肽段。
通过 HPLC 方法测定了蛋白酶在其适宜条件下酶解后水解物中 α- La 和 β- Lg的含量。经过计算得出其酶解率。
除胃蛋白酶外，其他 6 种酶对 α- La 的酶解率都为 ；而只有碱性蛋白酶将 β- Lg 酶解，其余均未完全酶解。可知α- La 比 β- Lg 更容易水解。对于 β- Lg，碱性蛋白酶对其水解，其次为木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下 β- Lg 不易酶解。因此，本试验选择碱性蛋白酶为适宜用酶，该酶是一种微生物蛋白酶，来源广泛、活力比较高、水解速度快、成本低，是较理想的工业用酶。而且该酶为液体酶，容易与底物充分作用。
乳清蛋白酶解的速率主要与其结构有关，乳清蛋白由于具有二硫键，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起过敏的原因。碱性蛋白酶则是内肽酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺键，可水解蛋白质分子内部的肽键，生成相对分子质量较小的多肽，因而能破坏蛋白质分子内部的抗原结合位点，有效降低蛋白的过敏原性。本试验的研究结论与前人研究结果一致。Mota 等人曾比较了胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶对乳清蛋白粉中 β- Lg和 α- La 的水解速率，结果表明碱性蛋白酶速率。Wroblewska 等发现可以利用碱性蛋白酶水解乳清蛋白，降低乳清蛋白的抗原性，以此来制备低致敏牛奶。沈小琴等人比较了几种不同酶水解乳清蛋白，发现碱性蛋白酶降低乳蛋白抗原性的效果。
2.3 不同蛋白酶水解物的水解度
本试验采用甲醛滴定法测定不同蛋白酶水解物的水解度。碱性蛋白酶水解物的水解度较大，表明碱性蛋白酶水解能力最强；其次为木瓜
蛋白酶；胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解度最小。以水解能力作为选择蛋白酶的评价指标时，应选择碱性蛋白酶，因其水解能力最强，酶的反应速度快，能满足实际生产的要求。但在采用碱性蛋白酶水解乳清蛋白过程中多采用限制性酶解，即在使 α- La 和β- Lg 水解的前提下，要尽量控制其水解度，主要原因是蛋白质充分酶解不仅会使成本增加，而且酶解产物的风味变差。蛋白质充分酶解后形成的游离氨基酸吸收比多肽的吸收差，而且影响产物的功能特性，使其乳化性及稳定性变差。

来源：惠合UHT灭菌机网