高产Nisin和高产LAB EPS乳酸菌共生株筛查

摘要：通过对 10 株产 Nisin 乳酸菌株和 10 株产 LAB EPS 乳酸菌株进行培养、筛选和测定，筛选出 3 株高产 Nisin 的乳酸菌株和 3 株高产 LABEPS 的乳酸菌株，进而对 3 株高产 LAB EPS 乳酸菌株和 3 株高产Nisin乳酸菌株进行复合发酵试验，最终筛选出可共生的高产 Nisin 乳酸菌株和高产 LAB EPS 乳酸菌株各 1株。
乳酸链球菌素 （Nisin） 亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由 34 个氨基酸残基组成。食用后在人体的生理 pH 条件和 α- 胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其他抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其他抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。可广泛应用于肉制品、乳制品、罐头、海产品、饮料、果汁饮料、液体蛋及蛋制品、调味品、酿酒、烘焙食品、方便食品、香基香料、化妆品等中。胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)：是一些微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属微生物的次级代谢产物，对微生物的生长有重要意义。
目前关于乳酸链球菌素和胞外多糖已有大量的文献报道，但研究高产乳酸链球菌素菌株和高产胞外多糖菌株之间共生关系的文献鲜有报道。
本文通过对 10 株产 Nisin 乳酸菌株和 10 株产LAB EPS乳酸菌株进行培养、筛选和测定，筛选出 3 株高产 Nisin 的乳酸菌株和 3 株高产 LABEPS 的乳酸菌株，进而对 3 株高产 LAB EPS 乳酸菌株和3 株高产 Nisin 乳酸菌株进行复合发酵试验，最终筛选出可共生的高产Nisin 乳酸菌株和高产 LAB EPS 乳酸菌株各 1 株。

1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株本试验所用的乳酸菌株为乳酸乳球菌 （Lacto-coccus lactis subsp.lactis），其菌种编号为 LA02、LA03、LA04、LA05、LA06、LA07、LA08、LA09、LA10、 LE03、 LE04、 LE05。 所用明串珠菌 (Leu-conostoc lactis)菌种编号为 Leu02、Leu03、Leu04、Leu05、 Leu06、 Leu07、 Leu08、 Lvan02、 Lvan04、Lvan05。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 菌株保藏及传代培养基
MRS 培养基、MC 培养基。
1.1.2.2 种子培养基、发酵培养基MC 培养基。
1.1.2.3 乳链菌肽效价测定培养基
以质量分数计：胰蛋白胨 0.8%、酵母膏 0.5%、葡萄糖 0.5%、NaCl 0.5%、Na2HPO4·12H2O 0.2%、琼脂 1.5%、pH 6.8，0.55×105Pa灭菌 30 min。
1.1.2.4发酵培养基 （代血浆培养基）
蔗 糖 130.0 g、 蛋 白 胨 2.0 g、 KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4 g、琼脂 15g、蒸馏水 1.0L，pH7.0～7.2。
1.1.2.5发酵培养基
a） 脱脂牛乳培养基：采用新鲜无抗牛乳，经脱脂后加入蔗糖 （12 g/ L） 和植物蛋白胨 （35g/ L），在115 ℃灭菌 15 min。
b） 代血浆培养基：蔗糖 130.0 g、蛋白胨 2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4 g、琼脂 15 g、蒸馏水1.0 L，pH 7.0～7.2。
c） 改良 MC 培养基。
1.2 分析方法和所用仪器
1.2.1菌种稀释液浓度测定
用 721 型分光光度计在 600 nm 处测定稀释后菌悬液的光密度，以同样稀释度进行试验。
1.2.2乳链菌肽效价测定
根据 WHO 规定，1 μg 标准批样商品乳链菌肽
为1 个国际单位。1 μg 纯乳链菌肽的效价为 40 个国际单位。测定指示菌为黄色微球菌 （Micrococcusflavus） NCIB8166。
1.2.3 溶液 pH 值的测定
用pH M82 型标准酸度计测定溶液的 pH。
1.2.4菌种活化
菌种首先在MRS 培养基中，于 37 ℃下培养24 h，并在 4 ℃下冷藏备用。发酵试验中菌种接种量的质量分数为 2%，并按试验要求进行培养和测定。
1.2.5胞外多糖的分离
发酵液采用12 000 r / min（4 ℃） 离心 30 min，取上清液加 3 倍体积浓度 95%的冷酒精沉淀 24 h，于 12 000 r / min （4 ℃） 离心 30 min，重复 3 次，沉淀物溶于重蒸水中，并于4 ℃下透析 24 h。
1.2.6 分析方法
光密度采用 721 分光光度计测定；pH 值用酸度计测定；总糖含量采用硫酸———蒽酮法测定, 以葡萄糖作为标准。
1.2.7 拮抗试验
a） 在改良 MC 培养皿上，将 LA02、 LA09、LA10 和 Leu02、Leu04、Lvan04 两两划十字线，看其有无拮抗性。
b） 在改良 MC 培养皿上，加上 NCIB8166 指示菌 ， 将 LA02、 LA09、 LA10 和 Leu02、 Leu04、Lvan04两两划十字线，确定其无拮抗性。
c） 将无拮抗性的菌株两两在脱脂牛乳培养基中培养，然后将其在代血浆培养皿上分离，确定其在脱脂牛乳中无拮抗性。

2结果与分析
2.1 10 株疑似产 N isin 乳酸菌株培养、筛选结果
2.1.1 产 Nisin 乳酸菌株筛选结果
通过试验，确定 LA02、LA09 和 LA10 高产Nisin。
2.1.2 对 LA02、LA09 和 LA10 产 Nisin 的效价测定
将乳酸乳球菌 LA02、LA09 和 LA10 种子接于MRS 肉汤培养基中，32 ℃静止培养 36 h，测定发酵液的光密度、pH 值及乳链菌肽效价。
2.2 10 株产 LAB EPS 乳酸菌株培养、筛选结果Leu02、Leu04、Lvan04 的LAB EPS 产量较高。
2.3 共生关系研究高产 Nisin 的乳酸乳球菌与高产 LAB EPS乳酸菌的共生关系，通过上面的试验可确定高产 Nisin 的菌株 LA02和高产 EPS的菌株 Lvan04 可共生。

来源：惠合UHT灭菌机网