短小芽孢杆菌产角蛋白酶液体发酵条件的优化

摘要：为提高 Bacillus pumilus ZW-36 产角蛋白降解酶能力，考察了初始 pH、羽毛浓度、无机盐、外加碳氮源等因数对其产角蛋白酶的影响。采用单因素试验和响应面分析法的 Box-Behnken 进行试验设计，建立了 FeSO4、MgSO4和K2HPO4的二次回归模型。得到产角蛋白酶的条件为：培养基初始 pH 6.5、羽毛 0.5％、NaCl 0.5％、FeSO40.036％、MgS0.025％、K2HPO40.073％、KH2PO40.035％，玉米粉 0.5％。在此条件下发酵 36h 角蛋白酶活达到 57.14U/mL，达到模型预测值的 96.7％，较优化前（38.27U/mL）酶活提高了 49.3％。
角蛋白是一种具有快 强抗性、难生物降解的硬蛋白，主要以动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角、鼻和爪等形式广泛存在于自然界中。据测定，羽毛的蛋白含量高达 90％，且含有常量元素、微量元素、维生素及一些未知生长因子，可作为动物饲料蛋白,以解决动物饲料蛋白源严重不足的问题以及废弃羽毛的污染问题。
目前发现可降解角蛋白的微生物已有 30 多种，但普遍存在角蛋白酶活力低的问题，这 一 直 是 提高羽毛利用率的瓶颈之一。 虽然菌体本身对角蛋白酶的产生起着决定作用， 但培养基的成分以及各成分的比例在很大程度上也影响着微生物的生长和产酶。因此优化培养基的成分以及相关的参数，建立的生产工艺， 是工业化生产酶制剂的首要任务。
本试验通过单因素试验，PB 试验以及响应面法对Bacillus pumilus ZW -36 的 发酵 培养 基 进 行 了 优化，进一步提高了该菌株羽毛降解和产酶能力，为角蛋白酶的工业化生产及进一步利用微生物技术手段开发羽毛角蛋白资源奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 羽毛及羽毛粉
菜市场家禽屠宰点收集生鸡毛， 用自来水洗净后烘箱 80℃烘干，用于发酵产酶。烘干后的鸡毛再用粉碎机粉碎后过 20 目筛即制成羽毛粉，用于测定酶活或发酵。
1.1.2 菌种
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus ZW-36），自然界筛选纯化后实验室保藏。
1.1.3 培养基
种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。初 始 发 酵 培 养 基 ：NaCl 0.5g，KH2PO40.35g，K2HPO40.7g，MgSO40.2g，CaCl20.02g，羽 毛 或 羽毛粉 5g，水 1000mL，121℃高压灭菌 20min，pH 自然。
1.2 方法
1.2.1 液体发酵及粗酶液制备
取培养 24h 的种子液 2mL 接于含 100mL 初始发酵培养基的 250mL 三角瓶中，37℃，160r/min 培养36h。发 酵 液 4℃，10000r/min 离 心 15min，上 清 液 即为粗酶液。
1.2.2 角蛋白酶活测定
角蛋白酶活力的测定方法参考 Gradisar等人，并有所改进。酶活定义；A280 值每增加 0.01 为1unit（U）。
1.3 试验设计
1.3.1 单因素试验设计
采用单因素法，对培养基的初始 pH，底物量，无机盐，外加碳氮源等因素进行分析，为 Plackett-Burman 试验做准备。
1.3.2 Plackett-Burman 试验设计
根据单因素的实验结果， 选取了 6 个对酶产量影响较大的因素， 其它因素取单因素实验确定的水平，通过 Minitab15 软件选用 N=12 的 Plackett-Burman 设计，以角蛋白酶活作为响应值，通过比较各因素的显著性水平，筛选出影响产酶的关键因素。
1.3.3 响应面设计
以 Plackett-Burman 试验确定的关键因素为自变量，角蛋白酶活为响应值，利用 SAS 8.2 软件设计 Box-Behnken 试验，通过试验数据拟合响应面模型，得到二次多项式，并最终确定发酵条件。

2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 诱导物的确定
向初始发酵培养基中分别加入 0.5％的羽毛粉、羽毛和头发，按 1.2.1 中的方法发酵。羽毛的诱导能力最强，头发最差，这主要因为羽毛和头发的角蛋白类型不同， 羽毛主要为 β-角蛋白，而头发主要为 α-角蛋白，且进一步研究表明， 羽毛添加量为 0.5％时酶活相对较高。故以 0.5％完整羽毛作为诱导物进行进一步研究。
2.1.2 培养基初始 pH 对发酵产酶的影响
以完整羽毛作诱导物，调节初始发酵培养基的初始 pH 至不同值，发酵后测定酶活。初始 pH 在 5.5-6.5 时，酶活力迅速上升，6.5 时酶活达到高峰， 快 过此值酶活则迅速下降。 说明此菌株生长在中性偏酸的环境中对产酶有利。 原因可能是此酸碱条件有利于羽毛空间结构的破坏以及微生物的生长和酶的诱导。
2.1.3 金属离子对发酵产酶的影响
在去除 CaCl2和 MgSO4， 含 羽 毛 0.5％，pH 6.5的初始发酵培养基中分别添加 0.02％的不同金属无机盐，其它培养基成分不变，研究不同金属盐对产酶影响。FeCl3、CaCl2、MnCl2对发酵产酶具有抑制作用，ZnCl2具有强烈抑制作用，CuSO4几乎完全抑制发酵产酶，MgSO4和 FeSO4对产酶具有较好促进作用。 这可能是由于 Mg2+和 Fe2+能激活酶的活性中心或直接参与酶活性中心的构成。 经进一步实验表明MgSO4和 FeSO4的添加量均为 0.04％时产酶较高。
2.1.4 磷源对发酵产酶的影响
向去除磷源的初始发酵培养基中分别添加不同含量的 KHPO4和 KH2PO4这两种磷源，探究其各自对发酵产酶的影响。两种磷源对发酵产酶都具有显著的影响（P＜0.05）。单独使用 K2HPO4做磷源其含量为0.05％时酶活较大（47.2U/mL），而单 独 使 用 KH2PO4做磷源，其含量为 0.035％时酶活达（42.6U/mL）。
2.1.5 外加碳源对发酵产酶的影响
向初始发酵培养基中分别添加 1％的不同碳源物质，以仅含 0.5％羽毛的处理作为对照，研究不同外加碳源对发酵产酶的影响。葡萄糖对产酶具有明显的抑制作用，麦芽糖、玉米粉和糊精对产酶均具有促进作用，促进作用依次减弱。麦芽糖促进作用最强，但麦芽糖价格相对较高，玉米粉价格低廉，容易获得且其促进作用与麦芽糖无明显差异（P＞0.05），故将玉米粉作为外加碳源进行研究。
2.1.6 外加氮源对发酵产酶的影响
有许多研究认为外加辅助氮源有利于细菌生长和产酶，也有研究认为会引起抑制作用，是高浓度的无机氮源。 本试验向含有 0.5％羽毛，pH6.5 的初始发酵 培养 基中分 别添加 1％的不 同 有 机和无机氮源物质，以研究外加氮源对发酵产酶的影响无论是有机氮源还是无机氮源，外加氮源对菌体产角蛋白酶均具有明显抑制作用（P＜0.05）。其中仅酵母浸出物的抑制作用较弱，而磷酸氢二铵可完全抑制产酶，干酪素可快 强地抑制酶的产生，与对照相比酶活降低了 95％。分析认为，可能羽毛作为一种含氮量很高的有机氮源，在被分解过程中本身己经满足细菌生长对氮的需求，因此添加辅助氮源反而产生不利影响。
2.2 Plackett-Burman 试验筛选重要影响因子
根据单因素试验结果， 按 1.3.2 中的方法进行Plackett-Burman 试 验 ，每 个 处 理 3 个 平 行 ，结 果 取平均值。
运用 SAS 软件对结果进行回归分析，并进行方差分析检验。对效价影响比较显著 （P＜0.05） 的因素有 X1（FeSO4），X5（K2HPO4）和 X6（MgSO4）。其中 X1、X2、X4和 X5对模型具有负效应。同时，模型相关系数 R2=92.02％，说明试验拟合度较高。 因此可以根据单因素试验和 PB 试验所确定的非显著性因素的水平为：羽毛 0.5％、NaCl 0.5％、KH2PO40.035％，玉米粉 0.5％、培养基初始 pH 6.5。
2.3 响应面分析确定因素浓度
2.3.1 试验设计及结果
以 Plackett-Burman 试验确定的 3 个关键因素为自变量，角蛋白酶活为响应值，利用 SAS 8.2 软件设计 Box-Behnken（BB）试验。
2.3.2 回归模型拟合及方差分析
利用 SAS 8.2 对其进行回归分析和方差分析，确定回归方程，并对其系数进行 T 检验。
由回归模型方差分析结果可知， 项和二次项对响应值具有较高的显著性， 说明响应值与试验因子之间不是简单的 线 性 关 系 。 模 型 的 P＞F=0.024719＜0.05，说明模型方程显著，仅有 2.47％的产酶量变异不能用该模型来解释。较高的 R2（92.36%）表明模型拟合度很好。较低的 CV 值（8.090998%）表明，本试验具有较高的可靠性及精密度。因此可以用该回归方程代替真实试验点进行分析。Y=56.46667-3.97875*X1-2.3875*X6+5.86125*X5-4.230833*X1*X1-1.9275*X1*X6+1.415*X1*X5-2.458333*X6*X6-3.8675*X6*X5-9.370833*X5*X5。
2.3.3 二次拟合响应面分析
用 SAS 8.2 软件对 3 个因素进行 3D 响应面分析。在任何 2 个因素之间都存在一个交互水平， 响应曲面为凸，表明角蛋白酶活存在一个预测较大值。响应曲面坡度较陡峭，表明响应值对因素X1X5以及 X5X6的交互作用比较敏感。因此，又进行规范型分析，考察拟合曲面的形状，获得了角蛋白酶的较大预测值及对应的各因素编码值。
回归模型存在稳定点，稳定点为较大值。Y 的较大估计值为 59.13225。将表 8 中的编码值转化为实际值， 可计算得到 3 个主要因素的水平实际值分别为：FeSO40.036％、MgSO40.025％、K2HPO40.073％。
2.3.4 回归模型的验证
将菌株分别在优化前和优化后的条件下进行产酶试验并进行比较。验证试验角蛋白酶活的平均值为 57.14U/mL， 比优化前的 38.27U/mL 提高了 49.3％， 验证试验平均值与回归模型方程预测的较大值（59.13U/mL）很接近，说明回归方程能够比较真实地反映出各因素对产角蛋白酶的影响。

来源：惠合UHT灭菌机网