臭氧特性及其杀灭耐热菌的应用研究

摘要：研究了臭氧在水中的溶解特性及对物体表面耐酸耐热菌的杀菌效果，以载玻片作为耐酸耐热菌的载体，采用通气悬液杀菌方式进行了单因素以及正交实验。

研究结果表明：臭氧的溶解性和杀菌能力受臭氧投加量、水温、水的 pH 值、以及水质的影响，正交实验显示臭氧投加量为主要影响因素。

耐热菌，又称耐热耐酸菌，最初在温泉水中发现，随后陆续在果园土壤以及森林等非热环境中发现。苹果汁中耐热菌主要来源于苹果在采收和运输过程中接触的泥土。耐热菌是影响浓缩苹果汁质量的重要微生物之一。他的耐热性很强，苹果汁中的耐热菌孢子在杀菌温度为 90 ℃时其D值达到 23 min，可以经受巴氏杀菌过程而存活，因此，用传统的热力杀菌方法很难实现对果汁中耐热菌控制。

同时由于生产环境快 其适合其繁殖，耐热菌一旦进入生产系统，即大量繁殖造成果汁和设备的循环污染。由于生产系统中管路复杂，管件繁多，存在清洗死角，要想通过清洗去除耐热菌是十分困难的。臭氧是一种新型的高效杀菌剂，他杀菌力强，作用时间短，无残留。目前已广泛应用于饮用水和医院等的消毒程序，但在果汁加工中尚未得到应用。本文研究了臭氧在水中的溶解特性及其对载玻片表面耐热菌的杀菌效果，以期为浓缩苹果汁企业应用臭氧杀灭系统中的耐热菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

臭氧发生器：湖南远快 臭氧设备有限公司（YCYGC- 0005 型，产臭氧量 5 g/ h）；耐热菌： （Alicyclobacillus acidoterrestris） 由恒兴果汁饮料有限公司化验室提供；K氏培养基：按美国库格实验室 （Krueger FoodLaboratories INC） 的标准配制。

1.2 试验方法

1.2.1 臭氧水制备及浓度测定

通过向水中通入臭氧气体的方法获得臭氧水，通气时臭氧气体经过一个砂芯过滤成较小气泡提高其溶解度。臭氧水浓度的测定方法按中华人民共和国城镇建设行业标准《臭氧发生器臭氧浓度、产量、电耗的测量》（CJ/T3028.2- 94）执行。

1.2.2 载体模拟试验

以载玻片为载体，载玻片上接种耐热菌，接种量约 9×104cfu / cm2，放入通有臭氧气的水中。分别在不同的温度和 pH 值下进行杀菌，作用一定时间，用蘸有中和剂的棉签头在染菌区反复涂抹，用洗脱液洗脱，然后对洗脱液进行活菌计数，计算杀灭率。

1.2.3 正交实验

根据 1.2.2 中几个单因素实验确定正交实验的因素及水平，选用 L9（34）表进行实验。

2 结果与讨论

2.1 臭氧在水中的溶解特性

先开机 5 min，待臭氧浓度较高时通入一定体积的水中并开始计时，每隔5 min 测定臭氧水的浓度，绘制成曲线 （如图 1 所示）。结果表明：随通气时间的延长臭氧浓度逐渐升高，前 20 min 变化较快，25 min 后臭氧浓度上升趋势渐渐平缓。且随着吸收液体积的增加，臭氧浓度达到平衡的时间有所延长。

出现以上结果的原因是臭氧在水中的溶解符合Henry 定律。臭氧溶解度随其在溶液中平衡压力的增大而增加，在试验过程中，随着通气时间的延长，臭氧在水中的平衡压力逐渐减小，溶解度也随之减小，造成浓度增加的幅度越来越小。

2.2 臭氧杀灭耐热菌的单因素实验

2.2.1 作用时间对杀菌率的影响

在（18±2）℃条件下分别向 3 组 200 mL 体积的水中通臭氧气，通气时间设定为 1 min、5 min、10 min，当臭氧浓度达到预定值时 （经检测其残余臭氧质量浓度分别为 6 mg/ L、18 mg/ L、28 mg/ L），放入已染菌的载玻片，并开始计时，各作用 30 s、60 s、90 s、120 s、150 s，同时以不经臭氧处理的载玻片为对照，计算杀菌率。

臭氧水浓度一定时，杀菌率随着作用时间的延长而升高；升高的幅度随着臭氧浓度的提高而下降。高浓度的臭氧 （28 mg / L） 能在短时间 （60 s） 内杀死绝大多数的耐热菌 （杀菌率 99.93％），而低浓度的臭氧 （6 mg / L） 则需要通过延长作用时间产生好的杀菌效果 （99.9％）。

作用时间在 30 s～90 s 时引起杀菌率变化的差异较大，所以在以后的正交实验中，该因素的水平设计为 30 s、60 s、90 s。

2.2.2 温度对杀菌率的影响

在不同温度 （梯度为 15℃、25℃、35℃、45℃） 下将臭氧通入 200 mL 的水中 （pH 值约5.3），当残余臭氧浓度达到预定值 （经检测分别为6 mg / L、18 mg / L、28 mg / L） 时放入染菌载玻片，作用一定时间 （杀菌时间统一为 60 s），以不经臭氧处理的菌悬液为对照，计算杀菌率。

臭氧水浓度一定时，杀菌率随着温度的升高而下降；下降的幅度随着臭氧浓度的提高而减小，出现这种结果的原因是由于一方面温度升高不利于臭氧的吸收或者高温促进臭氧降解而降低臭氧的杀菌力，另一方面温度的升高也可以在一定程度上促进臭氧的活性增加而提高其杀菌能力，所以在 15 ℃与 35 ℃时，杀菌率基本没有下降，甚至 25 ℃时 （6 mg / L） 有所升高，但随着臭氧投加量的提高，温度的影响逐渐减弱。这和王芳等人的研究基本一致。基于本实验，在正交试验中，温度的水平设计为 15 ℃、30 ℃、45 ℃。

2.2.3 pH 值对杀菌率的影响

按通气时间 （分别为 1 min、5 min、10 min）分为三个实验组，每组 pH 值的梯度设计为 4、5、6、7。实验方法同 2.2.2，作用时间仍为 60 s，蒸馏水体积 200 mL，室温 （15±2）℃，实验重复 3 次，以不经臭氧处理的菌悬液为对照，计算杀菌率。

在 pH 值 4～7 之间，对于一定浓度的臭氧水，杀菌率随着的 pH 值的升高而下降；下降的幅度随着臭氧浓度的提高而减小，臭氧浓度为 28 mg / L 时杀菌率没有随 pH 值的升高而变化。出现这种现象是由于臭氧在酸性环境中比较稳定，但随着臭氧投加量的提高，pH 值的影响逐渐减弱。这和 Achen 等人的研究基本一致。基于本实验，在正交试验中，pH 值的水平设计为 4、5.5、7。

2.3 正交实验结果

由单因素实验结果确定正交实验的因素及水平。

根据正交实验的试验方法，采用 L9（34）表安排实验。

通臭氧气杀灭载玻片上的耐热菌的杀菌条件为 A1B2C3D2。

即水的 pH 值为4，水温 30℃，通臭氧气 10 min 后接触玻片 90 s，其中臭氧投加量是的影响因素。利用此条件进行的杀菌验证实验表明：该条件可地杀灭载玻片上的耐热菌。经过测试，厂里用于最后喷淋的水为回收的三效蒸发水。其水质基本相当于蒸馏水，pH 值在 4 左右，水温约 45℃。所以利用此水作为吸收液，制得合适浓度的臭氧水用来最后清洗管道，可望达到完全杀灭管道内壁污染的耐热菌之目的。且由于臭氧水的不稳定性，可利用挥发出的臭氧气杀灭液体不易接触的死角等处的耐热菌。

来源：惠合UHT灭菌机网