乳酸菌的分离及抑菌能力的初步研究

摘要：从不同的标本中分离出五株乳酸菌 D1、Y1、D2、EM2、EM1,并对其进行抑菌实验。结果发现 Y1 对大肠杆菌的抑菌作用较强; EM2 对枯草杆菌的抑菌作用较强; D1 对绿脓杆菌的抑菌作用较强; D2 对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强。
乳酸菌是一类能发酵利用糖类物质而产生大量乳酸的细菌, 从形态上分类主要有球状和杆状两大类。乳杆菌属的乳杆菌形态各异, 一般呈细长的杆状, 大多链状排列; 乳球菌属的乳酸菌一般呈链状排列, 几乎的乳酸菌都是革兰氏阳性菌。
随着现代医学、微生物学、营养学及市场经济的发展, 乳酸菌已广泛地应用于食品工业、农业和医药等行业, 其研究热点主要是开发乳酸菌素作为新型的天然食品防腐剂、饲料添加剂和医用用剂等。近年报道乳酸菌、乳酸菌素的文献资料越来越多, 主要集中于新菌株和高产菌株的筛选以及对乳酸菌素的遗传因子的鉴定及结构基因的克隆和排序。大力进行乳酸菌的研究不仅具有重要的理论意义, 而且具有广阔的应用前景, 但目前国内外只有Nisin 等少数细菌素被证明在食品和生物医学领域有重要的经济潜能。为此, 本文利用酸奶等为材料,分离出乳酸菌, 比较其抑菌能力, 旨在得到有抑菌能力或抑菌能力较强的菌株, 希望从中提取新的细菌素。

1 实验材料
1.1 样品
大亨酸奶: 珠海维维大亨乳业有限公司;
达能酸奶: 广州达能酸乳有限公司;
伊利酸奶: 内蒙古伊利实业集团有限公司;
EM液: 广州三兴生物技术有限公司;
1.2 菌种
大肠杆菌 W1485、金黄色葡萄球菌 A209、枯草杆菌、绿脓杆菌, 均为遵义医学院珠海校区免疫与病原生物教研室保存。
1.3 培养基
MRS 培养基、蛋白胨水培养基、蛋白胨葡萄糖水培养基、葡萄糖产气培养基、产 H2S 培养基、产氨培养基、基础培养基。

2 实验方法
2.1 乳酸菌的分离
分别取 0.5 mL 的伊利、达能、大亨酸奶与 EM菌液置于试管中, 加生理盐水 5 mL 稀释, 取稀释液 0.2 mL 涂布于 MRS 培养基平板上, 37 ℃恒温培养箱培养 48 h。挑取接触酶阴性、革兰氏染色阳性的可疑菌落, 进行分离、纯化 3 ~ 4 次后, 再挑取纯化的菌落于试管斜面培养基中保存。
2.2 乳酸菌的鉴别
2.2.1 乳酸菌的形态学鉴定
菌落形态: 观察分离培养基平板上菌落的形态, 并记录。
细菌的形态: 用接种环挑取所分离的菌落进行革兰氏染色, 在 100 倍油镜下观察细菌的染色性、形态、大小, 并记录。
2.2.2 乳酸菌的生理生化特性
接触酶反应、葡萄糖产气实验、甲基红实验、吲哚实验、明胶液化实验、产 H2S 实验、产氨实验。
2.3 乳酸菌的抑菌能力研究
a) 将乳酸菌接种于液体 MRS 培养基中 37 ℃发酵 3d。
b) 分别在基础培养基上涂布大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌。用的小滤纸片 ( 直 径 约 6 mm) 吸 取 D1、 Y1、 D2、 EM1、EM2、EM的菌液至饱和, 并将其贴在接种大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓绒杆菌、金黄色葡萄球菌的平板上, 37 ℃培养 1 d, 观察抑菌圈并测量其大小,以直径表示 ( 单位: mm) 。

3 实验结果与讨论
3.1 菌落形态特征
从酸奶和 EM菌液中分离出 5 种菌株, 其菌落特征与乳酸菌相似, 分别命名为 D1、D2、Y1、EM1、EM2。
3.2 菌体形态特征
对这 5 种可疑菌进行革兰染色, 菌体形态特征比较。
3.3 生理生化实验结果
结果可以确定分离出来的 5 种菌株是乳酸菌。参照伯杰细菌鉴定手册的有关内容并根据这五种菌株的形态,初步鉴定 D1、Y1 可能为保加利亚乳杆菌, D2、EM2 可能为嗜酸乳杆菌, EM1 为短乳杆菌。